最近几年，基于对绿藻和蓝细菌的一些测量结果，打破了我们长期认为的光合生物体内可变荧光完全来自光系统II的认知范式。通过比较光诱导的Fv＞700 nm和Fv＜710 nm的变化可以用来鉴定Fv(I)。强光诱导的Fv(I)在Fv＞700 nm时比在Fv＜710 nm时约大1.5倍。近期Ulrich Schreiber教授发表在Photosynthesis Research上的新研究成果以模式绿藻小球藻(Chlorella vulgaris)为研究对象，通过比较远红光(720 nm，大部分被PSI吸收)和可见光(540 nm，被PSI和PSII吸收)激发的光诱导长波荧光(＞765 nm)变化，进一步扩展了该方面的工作。该研究测量了由540 nm饱和光引起的可变荧光(Fv)多相上升曲线，将初始O-I1上升相归一化后，假定反映Fv(II)，结果显示出720 nm激发(720 ex)的 I2-P瞬态比540 nm激发(540 ex)的高2倍的。分析Fo(I)对Fo(720 ex)和Fo(540 ex)的贡献发现，Fo(I)720 ex比Fo(I)540 ex高2倍，这支持了整个I2-P瞬变是由Fv(I)引起的观点。F(I)/F(II)的激发比从 680 nm 到 720 nm 的两倍增加远小于作用光谱已知的PSI/PSII 的八到十倍增加。有人认为，测得的F＞765 nm并不代表PSI的大部分叶绿素，而是反映了一小部分具有吸收远红光特性的叶绿素形式(“red Chls”)。另外，基于相同的方法，即比较用720 ex和540 ex测量的多相上升曲线，Fv(I)也被证实普遍存在于其他各种光合生物中，如蓝细菌、苔藓、蕨类植物、高等植物叶片。
上述研究结果是由德国伍兹堡大学教授Ulrich Schreiber使用多激发波长调制叶绿素荧光仪Multi-Color-PAM和双通道叶绿素荧光仪DUAL-PAM-100组合的测量系统做出的。文章于2023年1月4日发表在光合作用专业期刊Photosynthesis Research上，标题为“Light-induced changes of far-red excited chlorophyll fluorescence: further evidence for variable fluorescence of photosystem I in vivo”。在本研究中Multi-Color-PAM充分发挥了它出色灵敏度与卓越时间分辨率(10 µs)相结合的特点，同时它还具有多个波长的激发光，非常适合于研究光系统捕光天线尺寸，反应中心关闭和开放，以及类胡萝卜素自由基参与进行的快速高光强淬灭(HIQ)。
2021年初Ulrich Schreiber教授曾在Photosynthesis Research上发表过一篇题为Evidence for variable chlorophyll fluorescence of photosystem I in vivo的文章。研究了绿色单细胞藻类小球藻、蓝藻聚球藻和淡绿色常春藤叶片，呈现的结果为体内存在可变PS I荧光Fv(I)提供了强有力的证据。这次通过测量远红光激发诱导叶绿素荧光的变化无疑为活体内存在光系统I可变荧光进一步提供了新的证据。(往期推文：科学家发现活体中光系统I存在可变叶绿素荧光的证据)
使用远红光(FR，优选720 nm)或可见光(优选540 nm)脉冲调制激发检测单元比较测量光诱导叶绿素荧光产量变化的实验装置框架图。光学单元的几何形状针对两种类型的测量光(ML)以及540 nm光化光(AL)和多周转闪光 (MT)的均匀照明进行了优化。脉冲调制荧光的相对产率是用由PamWin-3软件控制的Multi-Color-PAM荧光仪测量的。定制的540 nm LED阵列由DUAL-PAM-100的控制单元(DUAL-C)供电，并通过从MC-PAM获得的预编程触发信号进行控制。
使用720 nm(红线，720ex)和540 nm(蓝线，540ex)脉冲调制测量光测量暗适应的小球藻悬浮液得到的多相荧光上升曲线。荧光从I1-P的相变，720ex大于540ex。在MT诱导过程中，两个信号之间的差异在2 ms内保持在675 mV，然后在上升到P点期间增加到755 mV。由于720ex的PSI/PSII激发比毋庸置疑的高于540ex，这意味着上升P点的部分荧光必须来自PSI，因此反映了Fv(I)。
使用720 nm脉冲调制激发测量的多相荧光上升曲线，将Fo反卷积为Fo(I)和Fo(II)的贡献。Fo(540ex)由35%Fo(I)和65%Fo(II)组成，Fo(720ex)由52%Fo(I)和48%Fo(II)组成。540ex的Fo(I)/Fo(II) = 35/65 = 0.539，而720ex的为52/48 = 1.083。因此，720ex的Fo(I)/Fo(II)比率恰好比540ex大2倍。因此，Fv(I)/Fv(II)的比率也应比720ex比540ex高2倍。
暗适应后(PQ库部分还原)小球藻全部Fv(720ex)多相上升动力学的Fv(I)和Fv(II)组分的反卷积。
在弱FR背景光(PQ库预氧化)存在下，全部Fv(720ex)动力学的Fv(I)和Fv(II)分量的反卷积。
小球藻540ex和680ex(图a)，700ex(图b)，720ex(图c)的多相上升动力学。680 nm以上的激发波长下显示出“额外的Fv(I)”。
小球藻中“额外Fv(I)”的信息源自使用540ex 和红光-光红光光谱范围内的各种激发波长对多相上升动力学的比较测量。a: “额外Fv(I)”的动力学。b “额外Fv(I)”的振幅与红光-光红光激发波长的函数。“额外的Fv(I)”被缩放为O-I1振幅的分数。
使用720ex(红线)和540ex(绿线)测量的 3 种不同强度的540 nm光化照明开始时的暗-光荧光诱导动力学曲线探究Fv(I)对光化强度的依赖性。
0.1 μM DCMU(a)和1 μM DCMU(b)对用720ex和540ex测量的多相上升动力学曲线的影响。
不同光合生物各自720ex和540ex 测量的Fv值之间的差异。这些结果只是为了证明光合生物中“额外Fv(I)”现象的普遍性。截至目前，强光化光引起荧光产率的多相上升动力学几乎完全根据Fv(II)来解释。虽然人们普遍认为“光化学”O-I1(或O-J)相反映了PSII反应中心关闭时的Fv(II)，但“热”I1-I2-P(或J-I-P)相对此则给出了完全不同的解释。随着研究人员的新证据证明I2-P相反映了小球藻中的Fv(I)，我们必须重新考虑以前对多相上升动力学这部分的解释。至于前面的I1-I2阶段，新的文章以及Schreiber和Klughammer 2021的文章中提供的数据清楚地表明它反映了Fv(II)，这就提出了I1相对于I2 的淬火性质问题。文献中讨论了涉及PSⅡ受体和供体侧、氧化的PQ以及PSII 反应中心水平的“构象”变化的许多机制。一个关键观察结果是DCMU消除了这种猝灭。支持Schansker 等人的早期结论。基于 PSII 构象变化的淬火机制受到Magyar 等人的青睐。他们基于的结果是在DCMU存在的情况下对闪光引起的荧光上升的测量。在这些研究中，在饱和的1.5 µs闪光后达到中间荧光产率 F1，并且只有大量这样的闪光才能达到最大荧光产率 Fm。从 F1 到 Fm 的转变被认为反映了光化学诱导的蛋白质构象变化，这种变化在体内“对大部分Fv 负责”。鉴于本研究的结果，这种 Fv 对从 Fo 到 Fm(或 P)的整体增加的贡献似乎仅适用于 I1-I2阶段。然而，这不仅可以通过 DCMU 消除，而且还可以通过在黑暗中预还原 PQ 池来很大程度上抑制。前面得一幅图中，P、I1和“额外Fv(I)”的振幅分别为1.63、1.00 和 0.31。假设在小球藻中 Fv(I) = 2ד额外的 Fv(I)”几乎没有 I1-I2可能与 Fv 由于光驱动的构象变化有关。然而，不能排除当PQ库在黑暗中还原时会引起构象变化。任何进一步尝试回答I1和 I1-I2相淬火的起源都超出了本通讯的范围。在实际应用中，饱和脉冲猝灭分析具有特殊的价值，因为它可以评估样品在给定光照状态下的光合状态。在这些条件下，Fd下游的反应被光激活，Fv(I)的干扰被最小化。然而，当在暗适应后测量最大Fv/Fm时，需要特别注意，其中Fv和Fm的值包含大量的I2-P分量，因此也包含大量的Fv(I)。这个问题可以通过适应低强度背景照明来代替严格的暗适应来避免。预光照应激活 Fd下游的反应，而不会引起显着的能量依赖性非光化学猝灭NPQ。由此产生的 I2-P抑制不可避免地导致较低的Fv/Fm值。另一方面，当修正F(I)对Fo的贡献时，会获得更高的Fv/Fm值。当忽略Fv(I)的存在时，这可能会导致对光诱导荧光变化的误解。例如，非光化学猝灭(NPQ)通常参考暗适应后测量的 Fm 状态进行量化。当在中等光强度下照射时，最大荧光产量Fm'相对于Fm下降，这正式导致NPQ增加，而实际上Fm'的下降是由于光激活抑制I2-P相 PSI下游的反应。在NPQ的定量研究中应考虑到这一方面，方法是将暗适应后的 I2水平而不是Fm水平作为参考。90多年前，当Hans Kautsky发现可变Chl荧光时，当时还没有关于存在两个光系统的信息。此类信息在30年后逐渐出现，Chl荧光被证明是阐明PSII中水的分裂与PSI受体侧NADP还原之间的各种电子传输步骤的先驱工具。虽然很明显部分荧光源自PSI，但人们认为这是恒定的，仅对暗荧光Fo 有贡献。我们现在知道，与Fv(II)相比，Fv(I)的振幅确实很小。此外，Fv(I) 仅在相对较短的时间窗口(20到200毫秒)内用饱和光照射时瞬态发展。最后但同样重要的是，Fv(I)在连续光照和DCMU 存在下被抑制。虽然DCMU通过阻断二次电子传输在PSII初级反应的研究中非常有价值，但PSI不存在类似的抑制剂。据推测，这是迄今为止Fv(I)尚未被强大的时间分辨荧光测量技术检测到的主要原因，在过去的30年中，该技术已应用于许多研究两个光系统吸收的激发能的命运 。原理上，衰变相关光谱(DAS)允许对体内Chl荧光的特性进行详细和准确的分析。PSI和PSII荧光的贡献可以很容易地根据它们截然不同的寿命和衰变相关的激发和发射光谱来区分。然而，当作为检测Fv(II)的常规做法添加PSII抑制剂DCMU时，Fv(I)被有效阻止。当PSI下游的反应被预光照光激活时，Fv(I)的诱导也会被阻止。暗适应后，必须应用非常强的多次周转光脉冲以确保 PSI(铁氧还蛋白)受体侧的限制关闭，然后通过光激活再次打开，这在藻类和蓝藻中特别快。另一方面，由于可以预期Fv(I) 的寿命比 Fo(I) 的寿命长得多，并且相对于Fv(II) 应该有相当大的红移，因此可以通过时间确认其存在。当满足上述要求时，分辨测量应该不会太困难。1、Multi-Color- PAM 荧光仪被扩展用于使用 FR 脉冲调制测量光测量暗光 Chl 荧光诱导动力学。2、使用该测量系统，首次在波长> 765 nm处测量了PSI荧光激发F(I)的多相上升动力学。3、对原始720ex 信号中包含的相对较大的恒定背景信号进行量化和校正，因此不仅可以获取有关Fv(I) 的定量信息，还可以获得有关 Fo(I) 的定量信息。4、按照 Schreiber 和Klughammer (2021) 介绍的方法，重新调整 720ex 和540ex 响应，使其 O-I1振幅相等，因此所有F(II) 响应均等。5、从O-I1均衡Fv(720ex)和Fv(540ex) 响应之间的差异，推导出选择性Fv(I)响应，对应于720ex 与 540ex相比观察到的“额外Fv(I)”。6、分析Fo(I)和Fo(II)对Fo(720ex)和Fo(540ex)的贡献表明，在暗适应的小球藻中，720ex的Fo(I)/Fo(II)比值比540ex高两倍，假设Fo(I)/Fo(II) = 35/65与540ex 的合理比率。7、假设Fv(I)/Fv(II)与720ex的比率超过540ex的2倍，推断在暗适应的小球藻中，Fv(720ex)中包含的Fv(I)总计2倍“额外的Fv(I)”。8、基于此Fv(I)信息，对Fv(II)动力学进行了解卷积，它与原始Fv(720ex)动力学非常匹配，直至约20 ms，Fv(I) 开始发展。此后，Fv(II)开始饱和，而Fv(I)在约200 ms时显示瞬态峰值。数据支持 I2-P(或 I-P)阶段归因于Fv(I) 的观点。9、正如在小球藻中，取决于实验条件，不能始终区分不同的 I2阶跃或拐点，I2水平被定义为P和I2水平之间的差异等于Fv(I)振幅，即测量的“额外Fv(I)。”10、在较低光化强度下使用720ex和540ex进行的暗光感应动力学比较测量表明，当无法区分I1和I2水平时，一些Fv(I) 也隐藏在“经典”考茨基效应(O-I-P-S 瞬态)的峰值中。11、发现 DCMU 可以“从上方”抑制I2-P相位，这与最大 F(II) 由I2而不是 P(或 Fm)指示的结论一致。12、使用540ex 和680-740 nm范围内的各种激发波长的比较测量表明，“额外的 Fv(I)”在波长⟩> 680 nm 时产生，并在约720 nm 处达到峰值。13、虽然Fv(I)在“红降”光谱范围内的发展定性地与众所周知的PSI/PSII激发从PSI和PSII 作用光谱中增加一致，但观察到F(I)/F(II)激发比率的2倍系数和有效PSI/PSII 活性的8-10 倍系数存在明显差异。提出了“红色 Chls”在确定在波长⟩> 765 nm 时测量的F(I) 和 F(II) 特性中的可能作用。14、重新审视了Schreiber 和 Klughammer (2021)中的F > 700与F < 710数据，其中F < 710 响应中相对较大的I2-P振幅似乎反映了“太多”F(I) < 710。精细分析 这些数据显示Fo(I) > 700/Fo(I) < 710 = Fv(I)⟩> 700/Fv(I) < 710 = 1.48，当激发比F(I)/F(II) = 假设F < 710 为 35/65。得出结论，活体内F < 710确实包含比通常假设更多的F(I)，这与过去10年许多实验室发表的报告一致，即LHCII是PSI天线系统的组成部分。15、使用 720ex 和540ex 对各种不同的光合生物进行的比较测量表明，所有这些生物中都有大量“额外的Fv(I)”。在蓝藻中发现了一个特别大的“额外 Fv(I)”(几乎与 O-I1相一样大)，因此似乎特别适合在体内进一步研究Fv(I)。—— 参考文献 ——
1、Schreiber, U. Light-induced changes of far-red excited chlorophyll fluorescence: further evidence for variable fluorescence of photosystem I in vivo. Photosynth Res (2023).
2、Schreiber, U., Klughammer, C. Evidence for variable chlorophyll fluorescence of photosystem I in vivo. Photosynth Res 149, 213–231 (2021).
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