海洋微生物无处不在，通过光合作用和生物地球化学循环等关键过程，在海洋中发挥着基本作用。由于其很高的更替频率和不完整的分布，监测时需要在正确的时间和空间取样。使用两个在线流式细胞仪系统对那不勒斯湾沿岸地区的海洋微生物进行了监测，验证一种新的概念，证明该技术可以作为一个实时水质报警系统的有用工具。建议将细菌和微型浮游植物浓度作为水质的一般指标，这是评估环境条件变化的影响所必需的第一步，随后将深入分析群落组成是否存在病原体或其他指标。在调查期间，我们发现在未经处理的城市废物排放区或河流输入区细菌浓度高。一般说来，细菌的丰度与盐度呈负相关，这表明它们利用陆地来源的有机物进行生长。所使用的技术方法也是根据旨在评估和改善欧洲海洋水域质量的欧洲指令2008/56/EC，是监测沿海地区的一种有用和快速的方法。海洋微生物具有高度的动态性，对生态系统性质的变化反应非常快，从而导致急性污染事件为了捕捉这些反应并确定其原因，需要高频准确的测量。大多数用于监测海洋微生物的方法都存在重复性低、响应时间长和对劳动力要求高的问题。流式细胞术提供了一个解决这些限制的方法，允许快速、准确和可复制的海洋微生物计数，并在海洋生态学研究中得到了广泛的应用。流式细胞术是一种利用散射和荧光来鉴别和计数细胞类型的非轴测、基于单细胞的方法。由于光合色素的自荧光性，光合微生物可以直接分析，而非自荧光微生物（如异养细菌）则需要在分析前进行染色。染色步骤需要样品处理和孵育时间，这是正确评估细胞浓度所必需的。在环境科学中，自动流式细胞术已用于自发荧光微生物和染色后的异养细菌。我们将这两种方法结合起来，分别使用了用于在线分析光营养微生物的Cytosense（CytoBuoy BV）和连接到海洋航行船的泵的OnCyt自动流式细胞仪（OnCyt Microbiology AG）。证明了高空间分辨率监测表面微生物分布是可行的，并提供了有用的第一手信息，可用于快速和实时地指示水质。2017年6月19日在RV Vettoria上采样。地表水由船泵通过在线热盐计 (SBE45 MicroThermalSalinograph，Seabird Electronics)，测量温度和盐度，并通过在线荧光计测量总荧光(CycloPS7，Turner Design 连接databank）。然后，水流过采样装置（Cytobuy BV)，并依次通过Cytosense流式细胞仪（Cytobuy BV）和OnCyt在线流式细胞仪。
Cytosense每2分钟分析一次样品，而OnCyt每13分钟（取决于染色时间）分析一次样品，对应每1km 采样一次，取决于船速。常规流式细胞仪分析的离散样本每10分钟在表面采集一次，以验证onCyt计数。在，将这些样品固定、冷冻并稍后在实验室用SYBRGreen染色后进行分析。从CytoSense中，获得了Synechochoccus sp（蓝藻）、微微真核生物（1-3μm大小的混合种群）和纳米真核生物的计数（2-10μm大小），同时onCyt提供非荧光，主要是异养细菌的浓度。尽管对于自养微微浮游生物（蓝藻和微微真核生物），onCyt系统与传统流式细胞术的比较已有报道，而且对于异养微生物，onCyt系统已用于淡水系统，但其在海水中的应用仍需测试。因此，我们调整了染色方案，以适应onCyt在培养温度和时间方面的需要。为了保证测量的准确性，在含50 mM EDTA染色之前，样品中加入多聚甲醛和戊二醛的混合物（1%和0.05%最终浓度）。使用CytSense和onCyt获得的细胞计数与通过常规流式细胞术获得的计数显著正相关，如图所示，对于细菌，计数和亚群（高核酸，HNA和低核酸，LNA，图1c和d）都适用。
图1 通过CytoSense、onCyt和常规流式细胞术（Verse）获得的数据验证。
a）CytoSenseVs Verse蓝藻聚球藻计数的相关性b）onCyt Vs Verse总异养细菌计数的相关性c）通过onCyt获得的异养细菌的流式图d）通过Verse获得的异养细菌生的流式图
上船后，两台流式细胞仪在热盐分析仪之后连接到船上的采样线上。然后海水被分成两条线，一条通向CytSense，另一条通向onCyt。两台仪器同时采集了样本。
图2 显示了船的轨迹以及巡航期间收集的温度、盐度和荧光值。
两个低盐度区域很明显，一个靠近港口（Torre Annunziata），另一个位于受萨诺河（Sarno）影响的区域。第一个位于离海岸一英里的城市垃圾收集站附近。第二条河流与萨诺河相对应，萨诺河流经几个农村和城市地区，然后排入那不勒斯湾。a）温度，b）叶绿素荧光，c）航迹，d）盐度。箭头表示盐度较低的地点，Torre Annunziata（上图）和Sarno（下图）
细菌总浓度显示出这两个区域对应的峰值，第一个区域（Torre Annunciata）的最高浓度为1.5 x 106cell/ml，第二个区域（Sarno）的浓度为1.4 x 106cell/ml（图3）。尽管HNA在Torre Annunziata占主导地位，但HNA和LNA均存在于Sarno现场（未显示），表明采样轨迹沿线的群落组成发生了变化。事实上，HNA和LNA现在被识别为不同的细菌集群，最终代表了相同的较大分支，但属于不同的分类单元，而不像以前认为的那样，是更多（HNA）或更少（LNA）活性细菌。
图3 样本轨迹（左侧）和中异养细菌总浓度（右侧）cell/ ml
在Sarno现场采集的样本显示存在大肠杆菌，这是近期粪便污染的指标，但在Torre Annunziata现场（Milva Pepi，pers.Comm.）没有，这表明在仅根据细菌总浓度正确评估人类健康风险之前，进一步进行细菌分析的重要性。有毒藻类也是如此，其中单独的分类鉴定并不总是与必须使用其他适当的检测方法证明的毒素的存在相对应。
自养微生物组分也显示出两个区域之间的明显分离，蓝细菌聚球藻（Synechococcus）在南部地区占优势，而微微真核生物和隐藻在北部地区占优势（图4）。这也证实了先前的观察结果，表明原核生物（蓝藻）与大型真核生物（微微真核生物和隐藻）对不同的环境线索做出反应，后者通常负责总叶绿素的峰值（如荧光模式所示，图1b）。
图4 样本轨迹（左侧）和a）聚球藻b）微微真核生物c）隐藻浓度cell/ml自动高频流式细胞仪被证明是一种检测海洋微生物的成本效益高、速度快的方法，允许实时测量细胞浓度与环境因素相关性，以便解释和潜在地用作水质标志，并为进一步干预铺平道路。反过来，微生物群落，特别是异养细菌，似乎是环境条件变化的有用标志，需要考虑并纳入水质评估，如欧洲指令2008/56/EC所要求的，其目标是在2020年内达到所有欧洲水域的良好环境状态（GES）。
由于细菌细胞总数可能不会进一步反映致病性或毒性对人类健康的风险，因此必须谨慎行事。然而，流式细胞术可能是首次筛选的一种有价值的方法，实时预警潜在的关键位点，以便通过其他方法进一步监测和控制。
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