水稻稻曲病(RFS)是由独特的花器官侵染性真菌病原体引起,已成为全世界水稻生产的一种严重病害。该病害不仅会造成巨大的产量损失(高达40%),还产生各种类型的霉菌毒素,污染稻谷,降低稻谷质量。近年来,尽管一些研究推测RFS与水稻花序性状相关,特别是与大花序、直立花序以及密集性花序等性状有关,但没有具体的相关研究来进一步证明这一猜测。
近日,福建农业科学院水稻研究所的研究团队在《BMC Plant Biology》在线发表了题为“SPR9 encodes a 60 S ribosomal protein that modulates panicle spreading and affects resistance to false smut in rice (Oryza sativa. L)”的研究论文,介绍了研究团队基于突变体图位克隆了一个调控水稻花序展开的新基因SPR9,该基因编码一个60S核糖体蛋白,同时影响水稻稻曲病抗性。该基因在水稻抗稻曲病和穗型改良育种方面有很好应用前景。
为了阐明参与水稻小穗发育的调控基因,研究团队筛选并获得了一个展开穗型的R20-1遗传背景spr9突变体(图1a)。将spr9突变体和野生型R20-1之间的表型进行比较,株高、穗长、有效穗数、穗粒数、结实率、千粒重、籽粒长度和宽度都没有显著差异(图1b-i)。
图1 spr9突变体和野生型R20-1的表型比较
前人研究提出水稻的穗型与稻曲病抗性有一定的关系。为了进一步比较spr9突变体和R20-1在稻曲病抗性方面是否有差异,研究团队用人工注射的方式接种了 spr9突变体和R20-1植株。结果表明,spr9突变体的病情指数为3,R20-1的病情指数为4,这说明spr9突变体比R20-1的稻曲病抗性更强(图2a、b)。
图2 U. virens侵染后spr9突变体和野生型R20-1的病症表现
研究团队通过遗传模式分析实验发现spr9突变体是隐性核遗传,且由一个单基因控制。为了找到spr9突变体的功能基因,研究团队利用spr9突变体和粳稻栽培品种Hui1586的杂交群体以及253个SSR多态性标记,找到了与性状共分离的5号染色体上的标记RM8211和RM5970,并通过重组单株鉴定,将候选基因初定位在了标记RM8211和RM597之间,其遗传距离为16.5 cM(图3a)。通过在候选区段内加密分子标记,筛选重组单株进行性状鉴定,研究团队最终将候选基因定位在了分子标记Indel5-18和Indel5-22之间物理距离为43kb的区段(图3b-d)。
研究团队对候选基因区段进行基因功能注释,发现在43kb的区域总共有6个能够正常转录全长cDNA的候选基因(图3e)。研究团队比较6个候选基因在spr9突变体与R20-1野生型的序列结构差异,发现6个候选基因中只有LOC_Os05g38520基因有1bp的插入/缺失变异(图3f),这意味着该基因很有可能是SPR9的功能基因,有三个外显子和两个内含子。
图3 候选基因的图位克隆与结构比较
为了确定spr9在粳稻遗传背景的表现,研究团队利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除了栽培粳稻品种Hui1586中的SPR9基因,总共获得了三个独立的转基因事件,并通过测序确定了编辑的有效性(图4a)。三个基因编辑株系与spr9突变体的表现一致,均表现出穗型展开的性状(图4b),且株高、穗长、有效穗数、穗粒数、结实率、千粒重、籽粒长度和宽度等农艺性状差异不显著,这表明Hui1586中SPR9基因的敲除会导致穗型展开的表型,spr9基因是展开穗型的spr9突变体的功能基因。
图4 敲除转基因单株与spr9突变体性状一致
为了进一步了解SPR9基因的功能,研究团队利用RT-qPCR技术检测水稻不同发育阶段SPR9基因的表达模式。结果显示,SPR9基因在所有组织中都有表达,包括2/4周龄的根、茎、叶,0.5-1cm、1-3cm、3-5cm、5-10cm长的花穗,以及萌发的种子、成熟的种子和愈伤组织。但SPR9基因主要在萌发的种子和5-10cm长花穗中表达(图5)。
图5 SPR9基因的表达模式
为了进一步分析SPR9蛋白的定位,研究团队构建了35S:SPR9-pSuper1300-GFP载体,并转化至农杆菌GV3101中。注射侵染烟草叶片后三天,用激光共聚焦显微镜观察SPR9蛋白的亚细胞定位情况。结果显示SPR9蛋白在定位在细胞核中(图6)。
图6 SPR9蛋白的亚细胞定位结果
综上所述,研究团队发现了一个新型水稻穗型控制基因SPR9,编码具有核定位信号的核糖体蛋白。CRISPR/Cas9基因敲除实验证实,SPR9基因是spr9突变体的功能基因。重要的是,spr9突变体提高了对RFS的抗性,而不影响主要的农艺性状,这表明spr9基因在未来的水稻稻曲病抗性及穗型改良应用中潜力巨大。
—— 参考文献 ——
He, N., Huang, F., Lu, L. et al. SPR9 encodes a 60 S ribosomal protein that modulates panicle spreading and affects resistance to false smut in rice (Oryza sativa. L)[J]. BMC Plant Biology, 2023, 23, 205.
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