杂草的竞争造成的产量损失限制了水稻（Oryza sativa L.）的生产。施用化学除草剂是目前水稻生产中控制杂草的有效方法，特别是在现代简化栽培系统的背景下。然而，长期大量使用除草剂，如5-烯醇丙酮酰亚胺-3-磷酸合成酶（EPSPS）、乙酰乳酸合成酶（ALS）和乙酰-CoA羧化酶（ACCase）的抑制剂，导致了抗除草剂杂草品种的出现，以及土壤中除草剂的高度残留，这限制了作物轮作。因此，水稻生产上迫切需要可替代的除草剂和培育相应抗除草剂的抗性水稻品种。
2009年以来，HPPD抑制剂类除草剂市场几乎逐年增长，成为除草剂市场增长很快的产品类型之一。HPPD抑制剂类除草剂全称是对羟基苯基丙酮酸双氧化酶（HPPD）抑制剂，它们通过抑制HPPD的活性，使对羟基苯基丙酮酸转化为尿黑酸的过程受阻，导致生育酚及质体醌无法正常合成，进而影响靶标体内类胡萝卜素的生物合成，促使植物分生、新生组织产生白化症状，最终导致杂草植株死亡。大多HPPD类型的除草剂结构上并不完全相关，但是作用效果相同。与其他除草剂相比，HPPD抑制剂的优势在于其广谱性、高效力、低毒性、高的作物安全性和良好的环境兼容性。因此，HPPD抑制剂是公认的具有优异潜力的水稻除草剂，硝磺草酮（MST）是HPPD抑制剂类除草剂中很重要的产品之一，常用于玉米田防治阔叶杂草和部分禾本科杂草。
近日，江苏里下河地区农业科学研究所的研究团队在《Plant Communications》在线发表了题为“CRISPR/Cas9-mediated editing of OsHPPD 3’-UTR confers enhanced resistance to HPPD-inhibiting herbicide in rice”的研究论文，介绍了研究团队利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a基因编辑系统对水稻HPPD抑制剂抗性基因OsHPPD的3’-UTR进行基因编辑，创造了水稻HPPD抑制性除草剂抗性新种质材料，且没有产生其他农艺性状的不利影响。
基因编辑已成为快速改进作物的有力工具，水稻的多个农艺性状基因已被成功编辑。基因编辑应用多是针对基因编码序列（CDS）或特定基因的启动子区域。然而，一些基因由于其特殊的功能，其CDS和启动子区域不能被编辑。相比之下，3′非翻译区（3′-UTR）是一个非编码的mRNA片段，参与基于mRNA的调控过程，包括mRNA的定位、稳定和翻译。此外，3′-UTRs还能调控许多蛋白质的特性，包括蛋白质复合物的形成、转录后修饰和蛋白质的构象变化。因此，3′-UTRs对高等生物的多个生物学过程至关重要，是潜在的基因编辑区域，可应用来创制新的水稻种质。
为了验证这一假设，研究团队尝试用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系统编辑OsHPPD基因的3'-UTR，创造HPPD抑制剂类除草剂抗性的水稻材料。在水稻中，OsHPPD（LOC_Os02g07160）包含一个265bp片段长度的3′-UTR（图1A）。为了评估OsHPPD基因3′-UTR中的哪些突变可能引起MST抗性，研究团队使用在线工具（http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR/CRISPR）在265bp的3′-UTR内选择了10个目标位点（TS1-TS10）进行编辑（图1B）。研究团队将得到的10个单向导RNAs（sgRNAs）分别克隆到CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a载体，然后将这些载体通过农杆菌导入粳稻栽培品种Yanggeng3012（YG3012）中，该品种适合种植在中国江苏省。最终，研究团队获得了135个靶位点突变的T2个体（来源于97个T0转化体）（图1C）。
图1A-C OsHPPD基因示意图及其3′-UTR的编辑位点和编辑事件
研究团队使用硝磺草酮（MST）来测试T2个体的除草剂抗性。为了确定田间条件下合适的MST剂量，研究团队在施用11种不同剂量的MST后，对10个籼稻品种和10个粳稻品种的存活率进行了测量。结果显示，籼稻品种对MST的敏感性高于粳稻品种。在施用45 g ai ha-1 浓度的MST后，籼稻品种和粳稻品种的平均存活率分别为50.5%和84.25%。提高MST的浓度会导致植株成活率显著下降。在施用120 g ai ha-1浓度MST后，粳稻品种和籼稻品种的平均存活率分别为2.95%和3.5%（图1D）。因此，研究团队最终选用120 g ai ha-1浓度的MST来评估所有135个T2突变体品系在田间条件下的除草剂抗性。经过14天的处理，只有两个品系（TS8-2#和TS8-8#）能够存活，而其他133个T2品系和野生型材料均已死亡（图1E）。
图1D&E施用阶梯浓度MST后不同粳稻和籼稻品种的存活率
通过一代测序，研究团队验证了TS8-2#和TS8-8#中sgRNA靶位点确实发生了编辑突变。值得注意的是，这两个抗性品系是在同一个位点产生了突变。其中，TS8-2#是纯合子，在2304位置有一个1bp的缺失，而TS8-8#是杂合子（WT/+1），在第2304位有1bp的插入（图1F）。研究团队通过PCR测序最终选择了两个无转基因的纯合子编辑系（TS8-2#-10和82TS8-8#-6）用于后续分析（图1G、H）。
图1F-H TS8-2#和TS8-8#中sgRNA靶位点编辑突变情况
为了进一步研究TS8-2#-10和TS8-8#-6的抗性水平，研究团队在温室条件下测试TS8-2#-10、TS8-8#-6以及野生型对不同MST剂量的反应。MST剂量梯度为0、0.125×、0.25×、0.5×、1×、2×、4×和8×，其中1×代表120 g ai ha-1。在施用480g ai ha-1浓度的MST后，野生型植株全部死亡，而TS8-2#-10和TS8-8#-6植株则存活下来，并达到未处理对照植株鲜重的44.2%和29.8%（图1I）。据此，研究团队绘制了植株鲜重的MST剂量反应曲线，作为计算MST GR50值（使生长减少50%的除草剂剂量）的函数曲线（图1J）。野生型的GR50值为71.14±6.12 g ai ha-1，比TS8-2#-10（338.63±26.33 g ai ha-1）和TS8-8#-6（263.87±19.34 g ai ha-1)的GR50值低得多。基于抗性指数（RI）的计算值，基因编辑品系TS8-2#-10和TS8-8#-6对HPPD抑制性除草剂表现出的抗性水平分别是野生型抗性的4.8倍和3.7倍。
图1I&J TS8-2#-10、TS8-8#-6以及野生型对不同MST剂量的反应
为了确定两个抗MST除草剂基因编辑品系是否对其他农艺性状产生不利影响，研究团队对未施用MST除草剂的田间条件下的植株农艺性状进行了测定。
结果显示，MST抗性株系TS8-2#-10和TS8-8#-6与野生型株系之间没有明显的表型差异（图1K）。这表明编辑水稻OsHPPD基因3′-UTR特定位点可以增加MST抗性，但不影响其他农艺性状。
图1K TS8-2#-10、TS8-8#-6与野生型的农艺性状表现
综上所示，本研究通过对水稻OsHPPD基因3'-UTR进行位点基因编辑，创造了水稻HPPD抑制性除草剂抗性新种质材料，且没有产生其他农艺性状的不利影响。此外，本研究强调了CRISPR/Cas9介导的优良基因3'-UTR基因编辑，可以促进植物重要农艺性状的改良。
—— 参考文献 ——
Wu Y, Xiao N, Cai Y, et al. CRISPR/Cas9-mediated editing of OsHPPD 3'-UTR confers enhanced resistance to HPPD-inhibiting herbicide in rice[J]. Plant Communications, 2023, 100605.
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