玉米是世界上最重要的作物之一，是重要的粮、经、饲兼用作物。玉米小斑病（SLB）、大斑病（NLB）和茎腐病（FSR）等病害给玉米产量造成了巨大的损失。鉴定抗性基因和培育具有多种病害抗性（MDR）的遗传材料是控制病害和减少产量损失的最有效方法。然而，目前已发现的具有MDR的抗性基因非常有限。已有研究证明使用CRISPR/Cas9工具编辑感病（S）基因（例如Mlo和MDR6）产生的基因组编辑材料是赋予重要经济作物抗病性的有效方法。对于植物抗性育种，挖掘和克隆新的感病（S）基因迫在眉睫。
在多种植物中，烟碱酸N-甲基转移酶1（NANMT1）是烟碱酸转化为葫芦巴碱（也被称为N-甲基烟碱酸）的关键酶。山东大学的研究团队前期的研究发现，当与NLR (Nucleotide-binding，leucine rich repeat) 蛋白Rp1-D21在烟草系统中瞬时共表达时，玉米ZmNANMT能够抑制NLR介导的超敏反应（HR）。携带杂合体Rp1-D21的玉米品系表现出自激活免疫的表型，包括生长迟缓和无病原菌侵染的HR病点。为了进一步验证ZmNANMT是否能抑制玉米中Rp1-D21介导的HR，研究团队前期通过pXG071载体构建了ZmNANMT过表达玉米株系。由于DsRed2荧光标记在糊粉层中特异表达，通过眼睛观察即可区分阳性和阴性的转基因种子。
近日，山东大学的该研究团队在以前的研究基础之上在《Plant Biotechnology Journal》在线发表了题为“Genome editing of the susceptibility gene ZmNANMT confers multiple disease resistance without agronomic penalty in maize”的研究论文，介绍了研究团队发现玉米中一个新的感病基因ZmNANMT，通过基因编辑ZmNANMT提高了玉米对多种病害的广谱抗性，并且不影响玉米其他重要农艺性状。
研究团队从15个独立的转基因株系中，获得了3个纯合基因型的ZmNANMT过表达的T3株系（OE-3、OE-4和OE-11），以及与其对应的阴性同胞株系（Neg-3、Neg-4和Neg-11），其蛋白质印迹（western blot）结果如图1a所示。研究团队将OE-3和Neg-3杂交获得含有杂合Rp1-D21的F1株系，F1植株显示出Rp1-D21蛋白1:1的分离比，包括OE-3×Rp1-D21、OE-3×no Rp1-D21、Neg-3×Rp1-D21和Neg-3×no Rp1-D21单株。在田间V6生长阶段，Neg-3×Rp1-D21植株在第6和第7片叶显现出非常明显的HR病斑（图2a&b）。而与阴性对照相比，OE-3×Rp1-D21植株的HR病斑则表现较弱（图2a&b）。在抽穗期，OE-3×Rp1-D21的植株明显高于其阴性对照Neg-3×Rp1-D21植株（图2c）。这些结果表明，ZmNANMT在玉米中NLR蛋白Rp1-D21介导的HR中起负调控作用，且过量表达ZmNANMT可以部分克服Rp1-D21介导的自激活免疫表型。
图1 过表达株系的蛋白检测和三个CRISPR/Cas9株系ZmNANMT的序列
为了确定ZmNANMT基因在玉米抗病中的作用，研究团队鉴定了ZmNANMT过表达株系的玉米主要病害表型，这些病害包括小斑病（SLB）、大斑病（NLB）和茎腐病（FSR）。结果显示，在田间条件下OE-3、OE-4和OE-11植株对SLB、NLB和FSR的感病性高于其对应的野生型同胞植株（图2d-f）。这表明ZmNANMT是一个玉米多种病害的的感病基因。
图2 ZmNANMT在玉米防御反应中起着负面作用，对其进行基因组编辑可赋予玉米多种病害抗性且不产生其他农艺性状缺陷
为了探明对ZmNANMT进行基因组编辑能否增强MDR，研究团队设计了两个单链向导RNA（sgRNA1和sgRNA2），利用CRISPR/Cas9系统来靶标ZmNANMT（图1b）。从12个独立的转基因事件中筛选到3个纯合子基因编辑株系：CR-6（sgRNA1和sgRNA2都有1bp的插入）、CR-8（sgRNA1有1 bp插入）和CR-10（sgRNA1附近有31bp的缺失）（图1b）。所有这三个基因编辑株系都是不含Cas9的，且有预测的开放读码框偏移（图1c）。通过调查在不同条件下T2或T3植株对不同病害的反应，研究团队发现CR株系对FSR、SLB和NLB的抗性分别明显高于与其对应的野生型同胞株系（图2g-i）。
图3 ZmNANMT的过表达植株的农艺性状
为了确定ZmNANMT是否对玉米的主要农艺性状有任何负面影响，研究团队在田间种植了OE株系和CR株系2年。表型鉴定结果显示，OE株系和基因编辑株系在果穗大小和其他农艺性状方面与对应的野生型同胞对照没有显著差异(图2j&k、图3和图4）。
图4 ZmNANMT基因CRISPR/Cas9编辑株系的农艺性状
综上所述，研究团队发现了ZmNANMT是一个新型植物感病基因，通过基因编辑能够增强玉米对多种病害的广谱抗性并且不影响玉米的产量。NANMT可以将烟酸转化为葫芦巴碱，其功能在不同植物物种中是保守的，CR植株的MDR的增加可能是由NA的积累引起的，NA可以增加植物的抗病性。本研究为培育优良多抗品种提供了新的基因资源。
—— 参考文献 ——
Li Y J, Gu J M, Ma S, et al. Genome editing of the susceptibility gene ZmNANMT confers multiple disease resistance without agronomic penalty in maize[J]. Plant Biotechnology Journal, 2023.
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