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Nature│中国科研团队通过基因编辑获得具有广谱抗病性且稳产的水稻株系
日期:2023-06-30 19:18:51

水稻是世界上最重要的粮食作物之一,是一半人口的主食,生产上常受到稻瘟病、纹枯病等多种病害威胁。由稻瘟病菌引起的稻瘟病每年造成的产量损失可以养活6000多万人。水稻适用于基因编辑技术,培育抗病特别是广谱抗病水稻品种,是实现作物病害绿色防控的有效措施。


2023年6月14日,Nature发表了华中农业大学李国田教授团队牵头完成的题为“Genome editing of a rice CDP-DAG synthase confers multipathogen resistance”的研究论文,该团队通过筛选病变模拟突变体(LMM)克隆到了“RBL1”广谱抗病基因,此突变体具有广谱抗病性但会造成严重减产。通过靶向基因编辑RBL1,获得了rbl1Δ12突变体,并经多年田间试验评估,该突变体具有广谱抗病性,但不会降低产量。


研究团队首先从KitaaKe水稻1500多份已全基因组测序的快中子诱变系中,筛选到了稻瘟菌抗性增强的名为rbl1的LMM,但该突变体具有低育性(图1a-f)。接种稻瘟菌后,与KitaaKe相比,真菌菌丝在rbl1中的传播受到限制,rbl1表现出ROS的显著上调、水杨酸的积累和植物防御相关基因的激活(补充图2)。对rbl1植株的分离群体进行遗传分析和测序,在RBL1基因中发现了一个29个碱基对(bp)的缺失(LOC_Os01g55360)(图1j)。蛋白序列分析和遗传互补实验证实RBL1是致病基因(图1k-p)。此外通过组织定量实验和GUS染色分析可知RBL1在所有组织中转录,在叶片中含量最高,且其表达受到稻瘟菌感染的诱导。


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补充图2  rbl1株系的植物防御相关基因表达、产量及遗传互补实验

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图1 从具有增强免疫的LMM rbl1中克隆到RBL1基因

为鉴定RBL1的生物学功能,通过酵母实验和脂质组学分析,RBL1作为一种完整的膜蛋白,具有CDP-DAG合成酶的功能(图2 a-c)。利用脂质组学技术在rbl1和KitaaKe水稻中测定CDS1相关的植物甘油酯代谢途径上的脂类,相对KitaaKe,rbl1水稻中磷脂酸(PA)和DAG的含量升高,磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰甘油(PG)的水平显著降低(图2d)。且磷脂酰肌醇的减少是磷脂改变最显著的结果(图2e)。

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补充图1 与胞苷二磷酸-甘油二酯合成酶1(CDS1)相关的植物甘油脂代谢途径

为了测试外源性补充磷脂是否可以挽救LMM表型,我们进行了化学互补试验,观察到外源添加磷脂酰肌醇的培养基,推迟了rbl1的病斑形成,而磷脂酸加速了的病斑形成(补充图5a - d)。将呼吸爆发氧化酶同源蛋白( RBOH ) 抑制剂二亚苯基碘化铵应用于rbl1,可以缓解LMM表型(补充图5e)。

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补充图5 外源添加磷脂酰肌醇延缓了rbl1的病斑形成

为了测试增加磷脂酰肌醇的含量是否可以挽救LMM表型,研究团队在rbl1中过表达水稻PIS1OsPIS1)。与rbl1相比,OsPIS1::rbl1系中的病斑比例减少(图)。2f-i),病程相关(PR)基因的表达量和稻瘟菌抗性降低,但高于KitaaKe(图2f-j)。同时OsPIS1::rbl1植株的磷脂酰肌醇含量恢复到KitaaKe的80%,PtdInsP和PtdInsP2的含量完全恢复(图2k)。同样在rbl1中过表达了磷脂酸磷酸水解酶编码基因OsPAH2(图2i)。OsPAH2::rbl1系中磷脂酸含量恢复,PR基因的表达水平仅略有下降,病斑比例和稻瘟菌抗性没有改变(图2m - o)。这表明rbl1中磷脂酸水平的升高仅以有限的方式有助于增强免疫力。因此该团队随后的研究重点放在磷脂酰肌醇衍生物上。

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图2  RBL1作为CDP - DAG合成酶发挥功能,rbl1中磷脂酰肌醇水平升高能更好地平衡抗性和生物量。

脂质印迹结果显示在rbl1植物中膜PtdIns(4,5)P2减少(图3a,b),为进一步分析真菌侵染过程中PtdIns(4,5)P2在原位的时空变化,研究团队构建了表达PtdIns(4,5)P2生物传感器的稳定转基因水稻品系。在Kitaake中沿质膜均匀分布,但在rbl1中,PtdIns(4,5)P2在质膜上的信号微弱,并存在于未知囊泡中(图3c),蛋白印迹Western blotting结果和荧光信号显著降低(图3d,e)。在稻瘟菌侵染后,PtdIns(4,5)P2迅速响应并聚集在侵入型菌丝尖端并侵袭外菌丝膜(EIHM)上(图3g,h),富集在BIC感染特异性结构中(图3i),但在rbl1中的细胞质未观察到,BIC形成率仅7.1%,远低于Kitaake的93.3%。综合来看PtdIns(4,5)P2在真菌和水稻的相互作用中发挥重要作用。

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图3  rbl1植株中富集在侵染特异性结构中Ptd Ins ( 4,5)P2减少

rbl1株系具有广谱抗病性,但产量降低了约20倍,为了平衡抗病性和产量,通过多重基因组编辑来构建和筛选编辑株系,发现12个碱基缺失的rbl1Δ12株系,表现出微小超敏反应样病变,且产生正常的种子(图4c,d),对10个稻瘟菌、5个Xoo菌株和2个稻曲病菌的菌株具有抗性(图4 e-j)。相应地,与Kitaake相比,rbl1Δ12感染稻曲病菌的颖花中真菌毒素水平降低了66.2 % (图4i )。通过无转基因种子进行大田试验,在不同地区低稻瘟菌的水稻产区种植,评估了多个关键农艺性状,株高、单株分蘖数、结实率、千粒重和籽粒产量。除株高外,rbl1Δ12Kitaake的所有测量性状无明显差异。综上所述,Kitaake水稻的RBL1Δ12等位基因具有强大的广谱抗病性,而不会降低产量。

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图4  rbl1Δ12具有广谱抗病性,且在田间试验中没有观察到产量损失

rbl1Δ12中缺失的4个氨基酸具有保守性,ROS水平响应几丁质与其他水稻类似,此外RBL1基因表达水平显著降低(补充图7b-d)。RBL1可回补rbl1Δ12,但rbl1Δ12不能回补rbl1(补充图7j-i),与rbl1Δ12与Kitaake杂交的F2群体中稻瘟病菌抗性表现也证实了互补结果,说明RBL1位点以反向剂量调节来促进免疫力(补充图7m-o)此外研究团队在两个水稻品种“日本晴”和“中华11号”中生成了RBL1编辑的株系,稻瘟病菌抗性增强,生长正常,类似于rbl1Δ12(补充图9)。

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补充图7  rbl1Δ12株系及等位基因的鉴定

本研究结果揭示了磷脂代谢与抗病性的关系,获得了具有广谱抗病性但不降低产量的株系,表明了微调参与感染特异性结构形成的宿主因子是平衡免疫力和产量的策略,为作物抗病研究方向做出重要参考,应加大基因编辑技术对负调节因子的改造利用,且对不同的LMM基因和作物具有重要的参考价值。

华中农业大学农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室、湖北洪山实验室李国田教授和加州大学戴维斯分校/劳伦斯伯克利国家实验室Pamela C. Ronald院士为该论文共同通讯作者。李国田教授团队博士研究生沙干、孙鹏为本论文共同第一作者。西北农林科技大学康振生院士、法国波尔多大学Yohann Boutté教授、作物遗传改良全国重点实验室郭亮教授、李强教授和谢卡斌教授、江西省农业科学院水稻研究所黄仁良副研究员、农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室郑露副教授、深圳华大生命科学研究院丘璨瑜副研究员、山东省农科院徐建第研究员、澳大利亚阿德莱德大学Jenny Mortimer教授等国内外科研机构研究人员参与了合作研究。


—— 参考文献 ——

Sha, G., Sun, P., Kong, X., et alGenome editing of a rice CDP-DAG synthase confers multipathogen resistance[J]Nature, 2023, 618, 1017–1023.

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