随着全球气候变化，可能会加剧作物疾病的爆发，如水稻的稻曲病。稻曲病（RFS）是由活体营养型病菌Ustilaginoidea virens（U. virens）引起的水稻穗部真菌病害，在全球范围内的水稻产区内广泛存在，目前防治这一疾病的战略主要依赖于使用合成杀菌剂，这会对环境和人类健康构成潜在风险，利用植物微生物群防治已成为促进植物健康和控制疾病的可持续方法。寄主植物与其微生物群之间的互惠作用可提供抗病性，这种相互作用的研究一般集中在根际微生物之间，植物地表的微生物群如何提供抗病性仍不清楚。浙江大学农学院王蒙岑课题组在植物抗病防御机制上取得新成果，近期在微生物领域国际著名期刊《Nature Microbiology》发表了“Phyllosphere microbiome induces host metabolic defence against rice false-smut disease”的研究论文。入选《Nature Reviews Microbiology》研究亮点（链接：https://doi.org/10.1038/s41477-023-01470-5）。该成果解析了宿主植物与穗部微生物互作防御病原菌侵染的作用机制。该研究通过整合微生物群落多样性测序，初级代谢分析，真菌毒素的定性定量分析、宿主基因组编辑、微生物移植试验和生化、遗传学等技术手段，发现具有穗部核心菌群的植物以抑制支链氨基酸（BCAAs）依赖性方式来防御稻曲病菌的侵染，且田间试验表明，亮氨酸与50%杀菌剂联合使用实现高浓度杀菌剂的防治效果。在RFS爆发期间，该团队发现同一水稻品种在同一地点的相邻田块出现发病与抑病两种相反的穗部性状。发病植株（DPs）和抗病植株（DSPs）两个地块的U. virens主要侵染源的种群密度无差异，进一步分析发现了发病和抑病植物的根际微生物群落组成和多样性无差异。在对穗部微生物群落分析时，抗病植株上发现了独特的穗部微生物群落，发病植株的穗部细菌群落丰度显著高于抑病植株，但多样性相反（图1a，b），在真菌群落上，抑病植物的丰度和多样性显著高于发病植物（图1d，e），基于Beta多样性的主坐标分析(PCoA)进一步揭示了这种差异（图1c，f）。对优势真菌分析，发病植株中为绿核菌属和镰刀菌属，抑病植株中依次为曲霉、黑孢属和莫氏黑粉菌属（图1g）。在细菌属上，乳酸杆菌和莱夫森菌是抑病植物所特有的（图1h）。微生物共生网络各种特征均相似，因此假设独特的穗部微生物群与宿主相互作用，从而对疾病抑制产生影响。
为分析水稻穗部的独特微生物群落的宿主的相关性，对发病株和抑病株的穗部局部代谢进行分析。其中总蛋白和可溶性糖没有显著差异（图2 a，b），但亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸在内的支链氨基酸在抗病植物的穗中显著富集（图2c）。通过穗部真菌毒素的定性和定量分析来研究外源代谢线索，在发病株中检测出稻曲病菌毒素包括A、B、C、D和F，呈下降趋势，抑病株中的稻曲病菌毒素A含量极低（图2d）。进一步分析结果表明，稻曲病菌毒素A的积累与15种氨基酸呈正相关，与支链氨基酸呈负相关（图2 e，f），其中与在穗部的优势支链氨基酸亮氨酸的高度负相关。该研究接下来主要关注改变的支链氨基酸这个独特的代谢线索。
为进一步分析微生物群落与支链氨基酸之间的相互作用，对抑病株穗部的微生物进行分离，获得了2357个微生物分离株，其中31个株具有抑病能力。对这些具有抑病能力的分离株进行鉴定并分类为11个属，还推断出在抑制疾病的植物的穗部显著富集的微生物类群（图3 a，b）。从抑制疾病的关键微生物类群，选取6株具有最高抑病率（>80%）的微生物分离株，分析它们与支链氨基酸的关系及抑病意义。实验结果表明，关键类群成功定植后穗部的亮氨酸水平明显升高（图3c）。且随着亮氨酸水平的升高，BCAA转氨酶基因（OsBCAT）的表达量在穗中受到抑制（图3d）。
图3 支链氨基酸、微生物群和水稻穗部疾病抑制之间相互作用解析利用CRISPR/Cas9编辑系统，该团队在水稻中成功获得了OsBCAT突变体，突变体的OsBCAT基因和蛋白序列如图（图3 e-g）。与野生型（WT）相比，OsBCAT突变体（Osbscat）的穗部亮氨酸水平明显增加，表明OsBCAT负调控水稻穗部BCAA水平（图3 h）。且与野生型相比，Osbcat突变体对U. virens的抗性显著增加，外源亮氨酸的补充和高抑病能力菌株的定植也使得WT对U. virens的抗性增加（图3 i），但关键分类群定植没有进一步增加的Osbcat突变体的抑病能力，说明水稻穗部中微生物群介导的疾病抑制是依赖于BCCAs的。为了阐明BCAAs抑制U. virens感染的具体作用模式，该团队研究了BCAAs抑制U. virens引起的水稻穗部RFS发病的剂量依赖性效应，结果表明，亮氨酸以剂量依赖性的方式抑制了U. virens稻曲球的形成（图4 a-f）。此外田间试验，亮氨酸与化学杀菌剂联用在减少了50%的杀菌剂用量下获得了良好的防治效果。在体外培养实验中，亮氨酸对U. virens菌丝体生长的抑制作用呈剂量依赖性（图4 g）。通过光学显微镜、电镜和相机观察发现暴露在亮氨酸条件下的U. virens在微观尺度(图4 h-m)和宏观尺度(图4 n-r)上都出现了明显的形态学缺陷。共聚焦检测结果显示在亮氨酸暴露条件下的U. virens的细胞核中观察到浓缩的染色质（图4 1,m），这说明发生了凋亡样细胞死亡，流式细胞仪检测，定量分析，DNA Ladder和DNA片段的跑胶均证实了这种凋亡性细胞死亡现象（图4 s-w)。综上所述，升高的BCAAs导致了U. virens细胞功能障碍，从而抑制了穗中的RFS。
图4 支链氨基酸暴露下条件下U. virens细胞功能失调的表征该研究进一步通过RNA-seq分析确定了暴露于亮氨酸后U. virens转录组的全局变化。结果表明，BCAAs诱导了U. virens的转录组重编程，511个基因在转录水平上发生了差异表达。通过GO通路富集分析表明，U. virens中被抑制的转录本主要参与真菌毒素生物合成、效应物、病原体-宿主相互作用和假设的致病性相关基因等过程（图5 a，b），也存在与细胞凋亡样细胞死亡相关的差异表达基因（图5 c），如U. virens中显著上调的丙酮酸代谢基因（UvKm1），抗氧化剂相关基因（UvATO2）和显著下调的氨基酸跨膜转运基因（UvAaT1）。此外观察到U. virens中l-氨基酸氧化酶编码基因（UvLAO2）的表达量显著增加。此外，该研究发现H2O2外源处理可诱导U. virens细胞凋亡样死亡，而抑制细胞内H2O2过量产生可显著降低U. virens细胞凋亡样死亡率（图 5f），这些结果阐明了过量产生的H2O2在凋亡样细胞死亡中的重要作用。该研究已经观察到这些H2O2引起的U. virens细胞凋亡样死亡的标记基因UvLAO2。靶向敲除UvLAO2后，U. virens中ΔUvlao2相比于野生型，H2O2积累显著减少，水稻穗上的致病性增强，对亮氨酸的敏感性降低（图5 g-h）。因此，UvLAO2介导的H2O2过量产生参与了BCCAs诱导的U. virens细胞功能障碍。更为有趣的是其他BCAAs，包括缬氨酸和异亮氨酸，也结合到UvLAO2相同的结构域，但亲和与作用位点不同（图5 i）。且缬氨酸和异亮氨酸具有一定的诱导H2O2积累和抑制U. virens感染的功能。综上所述，UvLAO2负向调节了U. virens的致病性，UvLAO2介导的H2O2过量产生是BCAA抑制U. virens在穗部感染的原因。
图5 U. virens中亮氨酸诱导的细胞功能障碍的转录组学分析该成果破译了宿主植物与穗部微生物联合防御病原菌侵染的分子机制，阐明了作物病害控残减毒防控技术的新靶点，为作物抗病品种的分子设计改良提供了新资源。—— 参考文献 ——
Liu, X., Matsumoto, H., Lv, T, et al. Phyllosphere microbiome induces host metabolic defence against rice false-smut disease[J]. Nature Microbiology, 2023.
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