如今市面上有很多被称为叶绿素荧光成像系统的设备。单就设备的型号来讲，已经不下十几种，如，***PAM，***CAM，***Explorer，***View等等，进口的，国产的，封闭式的，开放式的，多功能的，多光谱的，高通量的，那叫一个眼花缭乱。如果这个时候厂家再给你一堆花花绿绿的图片在您眼前不断的闪现，请问您该如何和判断这是什么？我要的是什么？好难！
叶绿素荧光成像系统是测量光合作用光反应能量转换过程释放的叶绿素荧光的成像工具。首先它是测量叶绿素荧光的，其次它可以成像。这下反而简单了。
测量叶绿素荧光的方法有很多种，目前受欢迎和应用广泛的是脉冲振幅调制(PAM)方法。下面的测量流程以脉冲振幅调制方法展开：在开始测量之前，叶片必须经过几分钟或者几十分钟的暗适应，这取决于测量前叶子所处光环境的光强度和植物物种。黑暗中叶绿素a荧光的最小水平Fo通过低强度测量光（Measure Light, ML）获得，而暗适应叶片的最大荧光产量Fm则用饱和光脉冲(Saturation Pulse, SP)进行评估。在光化光照明(Actinic Light, AL, 即施加的光强度）下，可以使用另一个饱和脉冲估计光适应状态下的最大荧光Fm′。在施加的光化光AL关闭之前测量荧光的稳态水平Fs。除此之外，在关闭AL后(有时需要开远红光Far Red Light, FR)，可以测到另一个叶绿素荧光的最低水平Fo′。Fm′和Fo′之间的差异是光下的最大可变荧光Fv′。根据这些测量的基本叶绿素荧光参数，可以计算出其他一些更常用于叶绿素荧光分析的参数。
叶绿素荧光测量解决了，下面该讨论成像了。叶绿素荧光成像可没那么简单，因为它不单单是拍照。拍照是一门光学艺术，风景，人物拍照讲究个构图得当，光线协调，亮暗对比，但是这些都不适用于叶绿素荧光成像。叶绿素荧光成像该考虑哪些因素呢？
首先要考虑的是测量区域光场的均匀性。所谓的测量区域光场的均匀性是指在成像区域内，各个不同位点的光强差异，差异越小，光场越均匀。光场内的光强包括测量光，光化光，饱和脉冲光，远红光。是否均匀是衡量叶绿素荧光成像数据是否有效的基本原则。因为只有在光场均匀的情况下，才可以保证成像区域内样品上的每一点接受到的光强是一致的，才可以进行多叶片同时测量，才可以进行横向异质性分析。否则，数据的有效性无从谈起。实践证明，荧光成像系统并不是成像面积越大越好，首先要考虑的是成像均匀。如果光场不均匀，再大的成像面积也是无效面积，外围和中心的测量结果也不具备可比性。
成像区域108个点的光强数据
其次要考虑的是工作距离。所谓的工作距离是指样品和测量系统的光源以及成像的镜头的空间距离。工作距离和光场的均匀性是密切相关的，换句话说，光场在一个工作距离下是均匀的，换一个工作距离就不一定了。其次工作距离还影响样品表面接收到的光强，距离越远接收到的光强越弱。实际应用中，如果工作距离发生变化，请务必重新做光强校准。否则样品实际接收的光强可能会与软件显示的光强不一致，不能正确反应样品的实际生理状态。
第三要考虑的是成像面积。所谓的成像面积是在设定的工作距离下测量区域光场均匀的有效面积。由此可见，成像面积和工作距离是密切相关的，光场均匀的区域才算有效面积，有效面积内的所有位置被无差别测量，图像内的所有信息才有可比性。
第四个要考虑的是光源光强。光强包括测量光，光化光，饱和脉冲光的光强。1.测量光，它既不能太强，也不能太弱。测量光太弱，无法将本底荧光全部激发出来，导致饱和脉冲测量的可变荧光Fv包含部分Fo，Fv被高估。测量光太强，会破坏暗适应的状态，导致测量的Fv被低估。2.光化光，它是在叶绿素荧光测量过程中诱导植物发生光合作用的光，通常强度是可调的。如果使用叶绿素荧光成像系统测量光响应曲线的话，光化光的强度通常需要达到1500-2000 μmol m-2 s-1。3.饱和脉冲光，它是用来测量和计算数据的光，在饱和脉冲期间，光系统被全部关闭，此时可以根据荧光发射的多少计算光化学淬灭和非光化学淬灭以及电子传递。饱和脉冲光的强度通常需要在3000-5000 μmol m-2 s-1以上。
总结一下，目前的叶绿素荧光成像系统还是一个平面2D应用的测量系统。您也许会说，植物是立体的呀！是的，植物没有错，但是考虑到光源，成像镜头和样品的空间距离是线性的。所以叶绿素荧光成像也是平面2D的，既然是平面测量系统，那么就要考虑成像区域的光场均匀性，就要时刻注意光源和镜头与叶片之间的距离，一个实验中的所有样品要以相同的距离进行测量。测量前准备阶段的光强校准也要在这个距离下进行。最后，叶绿素荧光成像系统的光源配置要满足叶绿素荧光测量的基本要求。
所以，我们想从专业服务的角度给各位老师和同学提两点建议。1.如果您正在使用叶绿素荧光成像系统，请认真思考上面提到的四点，非常重要。2.如果您计划采购叶绿素荧光成像系统，同样需要关注上面提到的四点，非常重要！
除了上面提到的四点以外，叶绿素荧光成像系统还有一些其他的技术参数需要注意，比如CCD的帧率，镜头的焦距，对焦，光圈等，这些参数也会影响成像结果，您把它比作一台数码相机就很好理解了。下面我们分别了解一下这几个参数。
1.CCD的帧率：理论上帧率越高，画面越流畅，但也不是帧率越高越好，它还取决于显示终端的显卡配置，被测光源类型。百度百科搜索“帧率”您会看到以下内容“大多数研究参与者认为调制光稳定。这种调制光的稳定感被称为闪烁融合阈值。然而，当调制光是不均匀的并且包含图像时，闪烁融合阈值可以高得多，数百赫兹”。如果我没理解错的话，调制光如果不均匀的话，闪烁融合阈值越高，图像稳定感越差。目前大多数叶绿素荧光成像系统的帧率为每秒30帧，属于正常水平，也相当的稳定可靠。另外一点，叶绿素荧光成像系统是一个”拍照“设备，不是一个“录像”设备。无论您使用的是脉冲式还是调制式，我们都需要用到饱和闪光测量叶片的“瞬时”状态并成像，输出的也都是2D图像，所以无需过分纠结帧率。
2.镜头焦距，对焦，光圈：这三个属于镜头的常规参数，其实没什么好说的，但是如果不注意的话还是会影响测量结果。A，焦距可以放大（拉近）/缩小（放远）图像，调整焦距并不会改变叶片与镜头和光源的距离。对测量不会产生本质性的影响。B，对焦可以使图像边缘更加清晰，通常调整焦距后都需要重新对焦，否则图像中的叶片边缘可能是模糊的，输出的荧光参数图像里的叶片边缘也是模糊的。C，光圈由通光孔叶片组控制的位于镜头中央的圆孔，光圈的大小决定了通过镜头到达检测器的光线多少。这里值得一提的是光圈F/值越小，光圈孔径越大，进入的光线越多，图像越明亮。所以在测量过程中最好不要随意更改光圈大小，特别是在用叶绿素荧光成像系统测量吸光度Absorptivity(Abs.)的时候，更是严禁调整光圈大小，如果不小心调了，需要重新调整Abs.测量所用光源的参数。如果之前没在意光圈大小，做预实验时发现测量光调到最低（Meas light Int.=1，Gain=1）AOI的Ft仍大于测量要求的上限值，此时需要先调整光圈，然后再到Settings设置测量参数。相反，如果测量光已经调到很大，AOI的Ft仍不到测量要求的下限值，也需要先调整光圈，然后再到Settings设置测量参数。
M系列的MINI版的探头是叶夹式的，可以直接夹住叶片测量即可，可以携带至野外使用。
M系列MICROSCOPY版是用于微藻或叶片显微结构组织水平测量的系统。
3D版是套机，光源和镜头都固定在框架上，不可拆卸，3D版除了叶绿素荧光成像以外可以用于小型植株（拟南芥）3D成像，分析植株的表型，如叶片数量，叶面积等。
Mobile版是MINI版的变形，是专为杂草或贴地植物设计的版本，符合人体工学的背带，延长的手柄大大提高了野外测量的便携性，非常适合研究除草剂对杂草作用效果，在除草剂的研发和杂草管理上积累了大量的应用。
IMAGING-PAM不仅仅是数据图像化那么简单。
IMAGING-PAM叶绿素荧光成像系统发表的文章非常多，涉及的样品类型五花八门，最常见的有拟南芥植株，单个叶片，藻液，藻斑，苔藓，珊瑚，甚至还有愈伤组织。针对不同的样品类型，测量时面临的实际问题也千差万别。比如，我们要求原位活体测量，尽量不要离体，但是有些植株体量比较大，无法整个放到成像区域，再比如有些样品叶柄比较短，也同样面临类似的问题，还有测量藻液，如何才能避免液面的反光等等。当我们遇到上面这些问题时该如何解决，怎么样才能保证测量是准确的？
具体情况需要具体分析，如果要展开讲，一篇文章也不一定能讲清楚，但我们还是根据经验还是总结了一些比较重要的注意事项，通过这篇文章分享给大家。304am永利集团科技作为WALZ的技术服务中心，对IMAGING-PAM特别熟悉，所以以它为例来讲，如果您用的是其它品牌或型号的叶绿素荧光成像系统，也可以参考，毕竟原理是相通的。倘若下文内容与您接受设备培训听到的测量理论有差别，欢迎各位读者朋友留言咨询，我们可以详细交流，共同学习。
首先，我们可以看看IMAGING-PAM成像的图片在文献中是什么样子的。然后再了解实际应用中有哪些使用要求，变形方式。下面的图片展示了IMAGING-PAM测量拟南芥植株，拟南芥平板，大型植株，盛放藻类悬浮液的多孔板，岩石附着藻，苔藓等出现在发表文章中的图片。不难看出，IMAGING-PAM在不同类型的样品中积累了大量的应用。
下面，我们以经典的MAXI-IMAGING-PAM来看看在实际应用中根据不同样品类型它有哪些变形方式。从下图中不难看出，只需要简单的更改组装方式，即可实现封闭，半开放，开放式测量。离体叶片，盆栽，大型植株，盛放藻类的96孔板均可轻松搞定。
不同组装方式可以让系统变得灵活，适用多变的实验需求，但是测量的本质没有变，还是叶绿素荧光。所以，一些测量的基本原则必须搞清楚，如工作距离，成像面积，测量区域光场的均匀性，光强（光化光+饱和脉冲）的强度等等，以上这些因素都会影响到您的实验结果。
1. 测量区域光场的均匀性：MAXI版的IMAGING-PAM光源阵列的LED排布是经过精心设计的，目的就是为了保证测量区域光场均一。经测算，MAXI 版IMAGING-PAM的光场均一性在标准工作距离18.5 cm时最优可达2%。MINI版本的IMAGING-PAM光源为四角相对排布，外围尺寸9.4×8.6 cm，但是为了保证成像区域光场均匀，实际的成像面积则仅保留了2.4×3.2 cm的有效区域。测量区域光场的均匀性同样是HEXAGON版本的旗舰参数。无论是MAXI版还是MINI版，再到现在最新的HEXAGON，德国WALZ始终坚守着该项技术的严谨性。
2.工作距离：为以MAXI版为例，工作距离根据组装方式的不同可以实现14.5-22.5 cm可调。标准设置下，打开成像单元红色的护眼罩，放入样品架，然后在样品架上放置叶片，叶片平展，此时叶片表面距离光源和镜头的距离即为标准工作距离18.5 cm。如果LED阵列和镜头脱离护眼罩，则可以很方便的调整工作距离。MINI版本的工作距离通常为固定的7 cm。HEXAGON版本的标准工作距离为20 cm。
3.成像面积：MAXI版工作距离为14.5 cm的时候，成像面积为7.5×10 cm；工作距离为22.5 cm的时候，成像面积是11×15 cm。MINI版工作距离为固定的7 cm，成像面积为2.4×3.2 cm。HEXAGON在标准工作距离下成像面积为20×24 cm。IMAGING-PAM的成像面积即为有效面积，有效面积内的所有位置被无差别测量。
4. 光源光强，以MAXI版IMAGING-PAM目前搭载的LED光源阵列为例，需要300 W的额外供电。标准工作距离18.5 cm，光化光最大可达1900 μmol m-2 s-1PAR，大大超过所有植物的光饱和点。饱和脉冲最高可达4000 μmol m-2 s-1PAR，足够关闭所有光系统的反应中心。HEXAGON-IMAGING-PAM的光源性能有了大幅的提升，标准工作距离20 cm，光化光最大可达3000 μmol m-2 s-1PAR，饱和脉冲最高可达5000 μmol m-2 s-1PAR，因此HEXAGON-IMAGING-PAM在工作距离上还有一定的调整空间。
IMAGING-PAM有非常多的应用，在我们整理的光合作用文献数据库中，是发表文章较多的型号，单个型号超过1800篇。2021年，IMAGING-PAM参与发表的相关论文曾两次登上专业期刊的封面。德国WALZ掌握叶绿素荧光成像系统的核心技术。IMAGING-PAM，值得您的信任~
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